广东某规模化猪场的一条龙饲养模式中，出现了一例猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)及副猪嗜血杆菌等细菌的混合感染。
作者：裴仉福 王阿明 王林川 徐小明 游新发 尚辉琴 李琳
摘要：广东某猪场出现了仔猪腹泻、呼吸困难等症状，根据其临床症状、剖检变化、RT-PCR及PCR等检测，确诊该场此次发病为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)及副猪嗜血杆菌等细菌的混合感染。
关键词：RT-PCR；PCR；猪繁殖与呼吸综合征病毒；副猪嗜血杆菌；混合感染
广东某猪场一条龙饲养模式，2020年9月12日发现，断奶仔猪35d时候陆续发病并迅速传播，从最初的少数病例到发病率为40%，病猪体温在40℃~41℃之间，眼结膜发炎、眼脸水肿，皮肤发红，被毛粗乱，约10%猪后腿关节肿胀，部分猪(约占5%)便秘，粪便呈球粒状，部分猪(约占5%)腹泻，呕吐黄色浑浊物，死亡猪鼻腔出血，部分保育猪(约占15%)有神经症状，且抗生素治疗无效，15%病猪出现不同程度的咳嗽，几乎所有病猪出现呼吸困难和耳朵、腹下呈紫色，皮下有点状出血，腹式呼吸。猪场自检非洲猪瘟阴性，根据临床症状及病理剖检，初步诊断为混合感染，并推测有猪繁殖与呼吸综合征感染。无菌采集了发病猪的病料（包括：扁桃体、肺脏、淋巴结、心脏、喉头等组织）送往华南动物疫病检测中心进行实验室诊断，分离病原，做RT-PCR试验。
1材料与方法
1.1 病料 该发病猪场送检的发病猪的扁桃体、喉头、肺脏、淋巴结、心脏等组织。
1.2 酶及主要试剂
MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit、PrimeScript One Step RT-PCR Kit、pMD18-T Simple Vector、TaqDNA聚合酶、DNA MarkerDL2000购自宝生物工程(大连)有限公司；Gel Extraction Kit为Biomiga公司产品。
1.3 引物设计与合成
参考GenBank上已发表的PRRSV JXA1株序列(登录号: EF112445)，用DNASTAR软件设计了一对，扩增ORF5基因。引物由TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司合成。
PRRSV上游引物P1:5'-ATG TTG GGG AAG TGC TTG ACC-3'；
PRRSV下游引物P2:5'-CTA GAG ACG ACC CCA TTG TTC-3'。预期扩增长度为603bp
1.4 涂片镜检
无菌采集肝脏、脾脏、肺脏、淋巴结等病料，涂片，干燥，甲醇固定后进行革兰氏染色镜检。
1.5 细菌分离鉴定
用接种环取肺、肝、脾、肾、淋巴结，接TSA血平板、巧克力琼脂(含NAD和酵母浸膏)，37℃培养，挑单菌落进行纯化培养。
1.6 药敏试验
挑单菌落接TSB兔血NAD液体培养基培养至对数生长期，取100μL菌液涂于巧克力琼脂平板，使用K-B法进行药敏试验，根据NCCLS(2006)的标准判定。
1.7 病料中RNA的提取
无菌采取送检的扁桃体、喉头、肺脏、淋巴结等病料2~3g，将其剪碎，加入约1mL的PBS缓冲液，用玻璃研磨器研磨成悬液，-20℃反复冻融3次，4℃5000rpm离心10min。取上清200µL，按照宝生物 MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit说明书提取总RNA，洗脱液保存于-20℃或直接用于RT-PCR检测。
1.8 RT-PCR扩增
用引物P1/P2对1.4的RNA进行 One Step RT-PCR。反应总体积25µl，包含PrimeScript One Step enzyme mix 1µl、2×One Step Buffer 12.5µl、RNA模板1µl，上下游引物各1µl，补水至25µl。反应程序为：50℃ 30min，94℃ 2min；94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸5min。扩增产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳分离后于紫外灯下观察，判定结果。
1.9 PCR产物克隆与序列分析
将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，按凝胶回收试剂盒的使用说明回收目的DNA片段，回收产物与pMD18-T Simple Vector连接后转化DH5α感受态细胞，经PCR鉴定正确的菌液送上海生工生物技术有限公司测序，将测序结果用DNAstar软件与参考序列进行比对分析。
2结果
2.1剖检病理变化
剖检发现，病死猪均出现不同程度的间质性肺炎，肺部出现明显肺炎病灶，小叶间隙加宽，气管和支气管呈有血性黏液渗出物。心包膜和胸腔大量积液，心脏有大量出血斑。喉头出血，淋巴结肿大，肾脏有少量出血点，胸腔及腹腔有纤维蛋白渗出。子宫粘膜表面粗糙钙化易脱落。
2.2 细菌分离镜检结果
SNC001菌落光滑、灰白色透明、直径大约0.5 mm、为革兰阴性、形态多样，从单个球杆状到长、细长以及丝状菌体。其SNC002菌落边缘光滑、湿润、透明、圆形为革兰阴性杆菌。
2.3 药敏结果
参照NCCLS(2006)标准以敏感(S)、中等(I)、耐药(R)3种形式对抑菌圈大小判断，分离细菌的耐药情况见表1。
表1 猪场分离细菌SNC001与SNC002对不同抗生素的耐药情况
RT-PCR检测结果表明，从送检的病料组织中扩增出了603bp的PRRSV目的片段(见图1)，与预期片段大小相符。
2.4 PRRSV的RT-PCR检测
M.DNA DL2000 Marker；
11.NVDC JXA1阳性对照；12~15.检测样品。
图1 PRRSV扩增结果
2.5 测序比较
测序后将结果用DNAStar软件分析发现，分离株ORF5基因核苷酸序列与2006年国内流行的高致病毒株一致，且与流行代表毒株JXA1株(GenBank登录号:EF112445)的同源性为99.2%，说明病死猪感染了猪繁殖与呼吸综合征病毒。
3讨论
3.1 根据流行病学、临床诊状、病理剖检及实验室检测得出猪场疫病原因主要是猪繁殖与呼吸综合征病毒混合感染大肠杆菌与副猪嗜血杆菌。
3.2 PRRSV可导致感染猪的免疫抑制，引起胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、巴氏杆菌、支原体、链球菌，葡萄球菌等细菌性疾病的混合感染、继发感染及持续性感染，使疫病难以根除。随着集约化养猪业的发展，病毒性疾病混合感染细菌疾病日趋严重，双重感染、三重感染、多重病症感染导致猪只大量死亡相继报道。病毒性疾病混合细菌感染是猪场暴发高热病的主要形式，加上猪场抗生素的泛滥使用导致的细菌耐药性增加，加重了疫病的治疗难度。
3.3 本次猪场疾病发病快，传播广，感染率高，死亡率高，综合诊断为混合感染。
3治疗方案
1、小猪方案：待猪群稳定后5~7天接种高致病性PRRSV活疫苗，以防下阶段再次发病（以呼吸道多见），根据药敏试验结果针对用药，肌肉注射头孢噻呋20mg/kg·bw以达到对细菌感染的防控，拌料微囊替米考星、氟苯尼考、普济消毒散和扶正解毒散，连用5~7天，水中加入复合多维+清解合剂，连饮5~7天，减少临床症状和提高猪的免疫力。
2、种猪方案：拌料微囊替米考星、普济消毒散、扶正解毒散和脱霉剂，连用10~14天，1次/月，连用4~6月；可在用药期间种猪接种2次免疫蓝耳灭活疫苗，间隔4周，待种猪生产稳定和断奶仔猪死淘在正常范围内，可改为种猪群普免蓝耳灭活苗一年4次，同时用热毒清和加免康连续保健5~7天。
3、隔离淘汰病猪，对病死猪进行无害化处理。
所以，针对混合感染或多重感染，要根据猪场疫病流行特点、临床症状、病理剖检及实验室检测进行综合诊断。根据诊断结果对症下药，避免不合理地用药(包括抗菌药物)而导致的更高死亡率。
